溶菌酶由溶酶体产生吗(【视频大赛优秀作品】中性粒细胞的分离)

Posted 2023-06-01

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溶菌酶由溶酶体产生吗(【视频大赛优秀作品】中性粒细胞的分离)

血液作为一种赋予生命的物质，蕴含着人体的生命力。自史前时代以来，人类就对血液着迷。在1879年-1880年间，Paul Ehrlich使用染料染色血片（图1），发现酸性和碱性染料能够识别嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。此后，Ehrlich继续发展了鉴定中性粒细胞中颗粒的中性染料。在那个时刻，粒细胞作为一种细胞类型，就正式登上了历史的舞台。

图1. 左：Paul Ehrlich；右：三酸（橙色G，酸性紫红色和甲基绿）用作分类白细胞染色[1]

作为固有免疫系统中的重要效应细胞，中性粒细胞占外周血白细胞总数的60%~70%。中性粒细胞来源于骨髓，具有分叶形或杆状的核，胞浆内含有大量的中性细颗粒。这些颗粒多是溶酶体，内含髓过氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性水解酶等丰富的酶类，这些酶与细胞的吞噬和消化功能有关。

中性粒细胞作为先天免疫反应的效应器，它们能够调节许多过程，例如急性损伤和修复、癌症、自身免疫和慢性炎症过程。近年来，中性粒细胞被认为是具有大量特殊功能的复杂细胞（图2）。本实验介绍了分离人外周血中性粒细胞的具体流程。

图2. 中性粒细胞功能图[3]

一、样品信息与耗材仪器

1. 实验样品信息

采用健康志愿者的新鲜血液

2. 试剂和耗材

试剂：

人外周血中性粒细胞分离试剂盒（TBDscience, China）（分离液试剂A、C，红细胞裂解液，细胞洗涤液）

RPMI 1640细胞培养基（Biosharp, China）

耗材：

50 mL离心管、15 mL离心管、1 mL枪头、10 mL巴氏管

3. 仪器

流式细胞仪（BD, USA）、离心机、显微镜

二、实验操作

人外周血中性粒细胞的分离

该作品在Bio-protocol第三届生物实验短视频大赛中荣获一等奖，欢迎访问网站查看原视频: https://s.bio-protocol.org?s=b154ae08fcdc3f43

1、取新鲜抗凝人外周全血15 mL。

2、准备一支离心管，依次加入10 mL试剂A，后小心叠加5 mL试剂C，形成梯度界面。用巴氏徳吸管小心吸取血液平分铺在分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。

3、低温，1000× g，离心30 min。

4、离心后，稀释液层下出现两层白色环状细胞层，取下层白色环状中性粒细胞层移至新的离心管。

5、加入2-3倍体积的细胞洗涤液混匀。400× g，离心10 min，弃上清。

6、加入3-4 mL红细胞裂解液重悬，4℃冰箱裂解10 min。300× g，离心10 min，弃上清。

7、重复步骤5，用细胞培养基重悬细胞备用。

三、注意事项

1、在分离液上方平铺血液，形成梯度界面时，如果样品较多，加样的时间较长，在离心前出现红细胞成团下沉属正常现象。

2、离心结束后出现分层现象时，由于个体差异或者分离条件不同，粒细胞层分离可能会不明显。

3、在红细胞裂解过程中，红细胞是否裂解彻底取决于红细胞裂解液的处理量和处理时间，若裂解过度将影响中性粒细胞活性，出现成团现象；若裂解不彻底，过多红细胞会影响后续实验。

四、结果展示

1. 镜下观察

2. 流式

对分离后的细胞进行Ly6G/6C-PE-鼠多克隆抗体和CD11b-FITC-鼠多克隆抗体双染后，用流式细胞仪检测人外周血中性粒细胞的纯度。检测结果为CD11b+Ly6G/6C+的细胞占总细胞的93.1%，分离得到的细胞可以用于后续实验。

图5. 流式检测分离得到的中性粒细胞纯度 [4]

注：

a：空白对照组

b：Ly6G/6C-PE-多抗单染组

c：CD11b-FITC-多抗单染组

d：CD11b-FITC-多抗和Ly6G/6C-PE-多抗双染组

五、作者及单位

作者简介

邓媛尹，三年级本科生，研究方向是病原微生物致病机制，目前主要集中于UPEC毒力因子对巨噬细胞的影响及其分子机制研究。

裘佳灵，四年级本科生，研究方向是病原微生物致病机制，目前主要集中于UPEC毒力因子对中性粒细胞的影响及其分子机制研究。

欧茜，博士一年级，研究方向是病原微生物感染免疫分子机制，目前主要集中于病原微生物的感染免疫及其分子机制研究。

江子妍，三年级本科生，研究方向是病原微生物致病机制，目前主要集中于UPEC毒力因子对巨噬细胞的影响及其分子机制研究。

指导教师

方佳琪，浙大城市学院医学院副教授

实验室研究兴趣

病原微生物致病及感染免疫的分子机制

六、参考文献

1. Kay AB. The early history of the eosinophil. Clin Exp Allergy. 2015 Mar;45(3):575-82. doi: 10.1111/cea.12480. PMID: 25544991.

2. Kay AB. Paul Ehrlich and the Early History of Granulocytes. Microbiol Spectr. 2016 Aug;4(4). doi: 10.1128/microbiolspec.MCHD-0032-2016. PMID: 27726791.

3. Liew PX, Kubes P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiol Rev. 2019 Apr 1;99(2):1223-1248. doi: 10.1152/physrev.00012.2018. PMID: 30758246.

4. 欧茜. 尿路致病性大肠杆菌毒力因子TcpC对中性粒细胞NETosis的影响及其机制研究[D].浙江大学,2021.DOI:10.27461/d.cnki.gzjdx.2021.003892.

Bio-protocol 简介

Bio-protocol于2011年在斯坦福大学创建, 致力于搭建全球权威的、高质量的生物实验方案分享平台，以助力科学发现。Bio-protocol期刊是Bio-protocol旗下的一份同行评审的国际学术期刊，发表高质量的生命科学实验方案，旨在提高科研的可重复性。至今，Bio-protocol已发表了来自全球上万名优秀科研工作者（包括多名诺贝尔奖获得者）的4000多篇实验方案，并且同Science、eLife等12家国际权威科学杂志建立长期合作关系，共同促进生命科学研究的可重复性。2019年Bio-protocol期刊已被PubMed Central，ESCI收录。